Використання та запобіжні заходи ультрафільтраційної центрифужної пробірки
1) Виберіть відповідну ультрафільтраційну трубку.Зверніть увагу, що УФ мембрани відрізняються за рівнем стійкості до різних хімічних речовин.Як правило, ультрафільтраційні пробірки з молекулярною масою відсікання 10 кДа можна вибрати з молекулярною масою, яка не повинна перевищувати 1/3 молекулярної маси цікавого білка, наприклад 35 кДа.Якщо молекулярна маса цікавого білка становить близько 10 кД, можна використовувати ультрафільтраційну трубку з граничною молекулярною масою 3 кД.
(2) Ультрафільтрація, щойно придбана, є сухою, з надчистою водою, доданою перед використанням і водою, повністю пропущеною через мембрану, крижану баню або холодильник, попередньо охолоджену протягом кількох хвилин.Потім воду зливають, тобто білкову рідину, і скільки додають, залежно від того, яка кількість не перевищує білу лінію у верхній частині пробірки.Операція легка, і ультрафільтраційну трубку потрібно попередньо охолодити на льоду перед додаванням білкового розчину.
3) І маса, і центр ваги повинні були досягти рівноваги.Зверніть увагу, що швидкість обертання та прискорення не надто швидкі, інакше безпосередньо пошкоджується ультрафільтраційна мембрана.Розпочали відцентрову ультрафільтрацію (центрифугу попередньо охолодили до 4 град.).Після того, як оберти на хвилину різних центрифуг були перетворені в g, вони були різними.Прискорення центрифуги відрегулювали до мінімуму, зменшуючи тиск на мембрану.Зверніть увагу: обов’язково залишайте центрифугу після того, як вона досягне цільової швидкості, або якщо у вас виникла проблема, ви не можете впоратися з нею вперше.Орієнтацію мембрани до шпинделя регулювали відповідно до інструкції (кутовий корпус центрифуги мембрана перпендикулярна осі).У практичному використанні загальна швидкість обертання нижча, ніж указана в інструкціях, тому термін служби центрифужної пробірки можна продовжити.
3) І маса, і центр ваги повинні були досягти рівноваги.Зверніть увагу, що швидкість обертання та прискорення не надто швидкі, інакше безпосередньо пошкоджується ультрафільтраційна мембрана.Розпочали відцентрову ультрафільтрацію (центрифугу попередньо охолодили до 4 град.).Після того, як оберти на хвилину різних центрифуг були перетворені в g, вони були різними.Прискорення центрифуги відрегулювали до мінімуму, зменшуючи тиск на мембрану.Зверніть увагу: обов’язково залишайте центрифугу після того, як центрифуга досягла цільової швидкості, або якщо у вас виникла проблема, ви не можете впоратися з нею вперше.Орієнтацію мембрани до шпинделя регулювали відповідно до інструкції (кутовий корпус центрифуги мембрана перпендикулярна осі).У практичному використанні загальна швидкість обертання нижча, ніж указана в інструкціях, тому термін служби центрифужної пробірки можна продовжити.
(4) Після концентрації до 1 мл, що залишився, візьміть 50 мкл буферного розчину, додайте 10 мкл потоку та подивіться, чи є синє забарвлення, щоб визначити, чи в ультрафільтраційній трубці відсутній білок.Якщо трубка негерметична, повторно налийте верхній шар і проведіть у нову трубку, щоб почати ультрафільтрацію.Щоб точно визначити, чи були пропущені пробірки, відцентрифугуйте протягом 10 хвилин з 5 мг BSA перед проточуванням, пропустіть на протеїновому клеї або сирому аналізі Бредфорда, і продовжуйте, додаючи решту концентрованого розчину білка (який працює на льоду та запобігає нагріванню білків), доки весь концентрат додано.Будьте обережні під час центрифугування, якщо відбувається осадження білків, що призведе до закриття пробірки.Якщо відбувається преципітація, визначте, чи є конкретною причиною преципітації надмірна концентрація білка чи невідповідний буфер;Перший можна вирішити за допомогою ультрафільтрації кількох ультрафільтраційних пробірок одночасно, зменшуючи концентрацію, а другий шляхом обміну різними буферними розчинами доти, доки білок не випаде в осад.
(4) Після концентрації до 1 мл, що залишився, візьміть 50 мкл буферного розчину, додайте 10 мкл потоку та подивіться, чи є синє забарвлення, щоб визначити, чи в ультрафільтраційній трубці відсутній білок.Якщо трубка негерметична, повторно налийте верхній шар і проведіть у нову трубку, щоб почати ультрафільтрацію.Щоб точно визначити, чи були пропущені пробірки, відцентрифугуйте протягом 10 хвилин з 5 мг BSA перед проточуванням, пропустіть на протеїновому клеї або сирому аналізі Бредфорда, і продовжуйте, додаючи решту концентрованого розчину білка (який працює на льоду та запобігає нагріванню білків), доки весь концентрат додано.Будьте обережні під час центрифугування, якщо відбувається осадження білків, що призведе до закриття пробірки.Якщо відбувається преципітація, визначте, чи є конкретною причиною преципітації надмірна концентрація білка чи невідповідний буфер;Перший можна вирішити за допомогою ультрафільтрації кількох ультрафільтраційних пробірок одночасно, зменшуючи концентрацію, а другий шляхом обміну різними буферними розчинами доти, доки білок не випаде в осад.
(5) Перші кілька кроків використовуються для концентрації білка, і якщо буфер потрібно змінити, обережно додайте новий буфер (ультрафільтрація через ультрафільтраційну мембрану 0,22 мкм) приблизно до 1 мл загального білка та повторно концентруйте приблизно до 1 мл протягом трьох послідовних разів, з кінцевим концентрованим кінцевим об’ємом залежно від бажаної концентрації білка, як правило, не більше 500 мкл, але також з точністю до 200 мкл.Досягніть 1000 × або більше в трьох випадках, по суті, стільки ж зміни буфера, як розраховано принаймні 10 × або близько того збагачення об’єму кожного разу.
(5) Перші кілька кроків використовуються для концентрації білка, і якщо буфер потрібно змінити, обережно додайте новий буфер (ультрафільтрація через ультрафільтраційну мембрану 0,22 мкм) приблизно до 1 мл загального білка та повторно концентруйте приблизно до 1 мл протягом трьох послідовних разів, з кінцевим концентрованим кінцевим об’ємом залежно від бажаної концентрації білка, як правило, не більше 500 мкл, але також з точністю до 200 мкл.Досягніть 1000 × або більше в трьох випадках, по суті, стільки ж зміни буфера, як розраховано принаймні 10 × або близько того збагачення об’єму кожного разу.
Час публікації: 09 листопада 2022 р