ПЛР, це полімеразна ланцюгова реакція, яка стосується додавання dNTP, Mg2+, факторів елонгації та факторів посилення ампліфікації до системи під каталізом ДНК-полімерази, використовуючи батьківську ДНК як матрицю та специфічні праймери як початкову точку подовження, Завдяки стадіям денатурації, відпалу, подовження тощо процес реплікації дочірньої ланцюга ДНК in vitro, комплементарної матричній ДНК батьківського ланцюга, може швидко та специфічно ампліфікувати будь-яку цільову ДНК in vitro.
1. ПЛР з гарячим стартом
Час початку ампліфікації у звичайній ПЛР полягає в тому, щоб не вставляти ПЛР-апарат у ПЛР-апарат, а потім програма починає ампліфікацію.Коли конфігурація системи завершена, починається ампліфікація, яка може спричинити неспецифічну ампліфікацію, і ПЛР з гарячим стартом може вирішити цю проблему.
Що таке ПЛР з гарячим стартом?Після підготовки реакційної системи модифікатор ферменту вивільняється при високій температурі (зазвичай вище 90°C) під час початкової стадії нагрівання реакції або стадії «гарячого старту», так що ДНК-полімераза активується.Точний час активації та температура залежать від природи ДНК-полімерази та модифікатора гарячого старту.У цьому методі в основному використовуються такі модифікатори, як антитіла, афінні ліганди або хімічні модифікатори для інгібування активності ДНК-полімерази.Оскільки активність ДНК-полімерази пригнічується при кімнатній температурі, технологія гарячого старту забезпечує велику зручність для приготування кількох реакційних систем ПЛР при кімнатній температурі без шкоди для специфічності реакцій ПЛР.
2. ОТ-ПЛР
RT-PCR (ПЛР зі зворотною транскрипцією) — це експериментальний метод зворотної транскрипції з мРНК у кДНК і використання її як матриці для ампліфікації.Експериментальна процедура полягає в тому, щоб спочатку витягнути загальну РНК у тканинах або клітинах, використати Oligo (dT) як праймер, використати зворотну транскриптазу для синтезу кДНК, а потім використовувати кДНК як матрицю для ПЛР-ампліфікації для отримання цільового гена або виявлення експресії гена.
3. Флуоресцентна кількісна ПЛР
Флуоресцентна кількісна ПЛР (кількісна ПЛР у реальному часі,RT-qPCR) відноситься до методу додавання флуоресцентних груп до реакційної системи ПЛР, використання накопичення флуоресцентних сигналів для моніторингу всього процесу ПЛР у реальному часі та, нарешті, використання стандартної кривої для кількісного аналізу шаблону.Зазвичай використовувані методи qPCR включають SYBR Green I і TaqMan.
4. Гніздова ПЛР
Вкладена ПЛР означає використання двох наборів праймерів для ПЛР для двох раундів ампліфікації ПЛР, а продуктом ампліфікації другого раунду є фрагмент цільового гена.
Якщо невідповідність першої пари праймерів (зовнішніх праймерів) викликає ампліфікацію неспецифічного продукту, можливість того, що та сама неспецифічна ділянка буде розпізнана другою парою праймерів і продовжуватиме ампліфікацію, дуже мала, тому ампліфікація другою парою праймерів, покращено специфічність ПЛР.Однією з переваг виконання двох раундів ПЛР є те, що це допомагає ампліфікувати достатню кількість продукту з обмеженої вихідної ДНК.
5. Touchdown ПЛР
Touchdown PCR – це метод підвищення специфічності ПЛР-реакції шляхом регулювання параметрів циклу ПЛР.
У ПЛР з дотиком температура відпалу для перших кількох циклів встановлюється на кілька градусів вище максимальної температури відпалу (Tm) праймерів.Вища температура відпалу може ефективно зменшити неспецифічну ампліфікацію, але в той же час вища температура відпалу погіршить розділення праймерів і цільових послідовностей, що призведе до зниження виходу ПЛР.Тому в перші кілька циклів температуру відпалу зазвичай встановлюють на зниження на 1°C за цикл, щоб збільшити вміст цільового гена в системі.Коли температура відпалу знижується до оптимальної температури, температура відпалу підтримується протягом решти циклів.
6. Пряма ПЛР
Пряма ПЛР означає ампліфікацію цільової ДНК безпосередньо зі зразка без необхідності виділення та очищення нуклеїнової кислоти.
Існує два види прямої ПЛР:
прямий метод: візьміть невелику кількість зразка та додайте його безпосередньо в PCR Master Mix для ПЛР-ідентифікації;
метод крекінгу: після відбору зразка додайте його до лізату, лізуйте, щоб вивільнити геном, візьміть невелику кількість лізованого супернатанту та додайте його до PCR Master Mix, виконайте ПЛР-ідентифікацію.Цей підхід спрощує експериментальний робочий процес, скорочує практичний час і дозволяє уникнути втрати ДНК під час етапів очищення.
7. СОЕ ПЛР
Сплайсинг генів шляхом подовження перекривання ПЛР (SOE PCR) використовує праймери з комплементарними кінцями, щоб продукти ПЛР утворювали ланцюги, що перекриваються, так що в подальшій реакції ампліфікації через подовження ланцюгів, що перекриваються, різні джерела методики А, у якій ампліфіковані фрагменти перекриваються і зрощені разом.Ця технологія в даний час має два основних напрямки застосування: конструювання злитих генів;сайт-спрямована мутація гена.
8. IPCR
Інверсна ПЛР (IPCR) використовує зворотні комплементарні праймери для ампліфікації фрагментів ДНК, відмінних від двох праймерів, і ампліфікує невідомі послідовності з обох сторін відомого фрагмента ДНК.
IPCR спочатку був розроблений для визначення послідовності суміжних невідомих областей і в основному використовується для вивчення послідовностей промоторів генів;онкогенні хромосомні перебудови, такі як злиття генів, транслокація та транспозиція;і інтеграція вірусного гена також широко використовуються зараз. Для сайт-спрямованого мутагенезу скопіюйте плазміду з потрібною мутацією.
9. dPCR
Цифрова ПЛР (dPCR) — це техніка для абсолютного кількісного визначення молекул нуклеїнових кислот.
В даний час існує три методи кількісного визначення молекул нуклеїнових кислот.Фотометрія заснована на поглинанні молекул нуклеїнових кислот;кількісна флуоресцентна ПЛР у реальному часі (ПЛР у реальному часі) базується на значенні Ct, а значення Ct відноситься до числа циклів, що відповідає значенню флуоресценції, яке можна виявити;цифрова ПЛР — це новітня кількісна технологія, заснована на методі одномолекулярної ПЛР для підрахунку нуклеїнових кислот. Кількісне визначення — абсолютний кількісний метод.
Час публікації: 13 червня 2023 р